YIJI 組織磷酸二酯酶總活性酶連續(xù)循環(huán)光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI組織磷酸二酯酶（PDE）總活性酶連續(xù)循環(huán)光度法定量檢測試劑是一種旨在通過磷酸二酯酶、肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）環(huán)核苷酸依賴性（包括cAMP或cGMP）磷酸二酯酶的總活性，以及抑制劑和調(diào)節(jié)劑檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

磷酸二酯酶（phosphodiesterase；PDE；EC3.1.4.17 ），又稱為環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase），包括腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cyclic adenine monophosphate；cAMP）或鳥苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cyclic guanine monophosphate；cGMP）。通過水解環(huán)核苷酸（cAMP或cGMP）的磷酸二酯鍵（phosphodiester?bond）產(chǎn)生5’-核苷（5’-nucleotides），使環(huán)核苷酸失活，達(dá)到調(diào)控第二信使分子環(huán)核苷酸的水平。其中環(huán)腺苷酸（cAMP）是存在于所有生命體細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，以調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、炎癥、蛋白磷酸化、基因轉(zhuǎn)錄等各種功能?；诎被嵝蛄?、底物特異性、調(diào)節(jié)特征、組織分布和藥理特性等，磷酸二酯酶家屬分為11種亞酶，例如PDE4/7/8是cAMP為底物；PDE5/6/9是cGMP為底物；PDE1/2/3/10是cAMP/cGMP為底物等，具有不同的生化特性、組織表達(dá)特異性和通路特征。 磷酸二酯酶與勃起障礙（erectile dysfunction）、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease；COPD）、學(xué)習(xí)障礙、情緒抑郁和記憶功能、神經(jīng)退行性病變、自動免疫性疾病、心衰和心肌梗塞等疾病有關(guān)。基于環(huán)核苷酸在磷酸二酯酶的作用下，產(chǎn)生為1－磷酸腺苷產(chǎn)物后，通過肌激酶（myokinase）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）系統(tǒng)，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值的變化（340nm 波長），來定量分析磷酸二酯酶的總活性。磷酸二酯酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）   毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent D）   微升

YIJI酶促液（Reagent E）        微升

YIJI底色液（Reagent F）    微升

YIJI陰性液（Reagent G）    微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；YIJI底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

臺式離心機(jī)：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備
• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過ye
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升YIJI裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>）
• 即刻放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g 
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
• 測定準(zhǔn)備
• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)15次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；YIJI底色液（Reagent F）避免光照
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 背景對照測定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－15分鐘讀數(shù)）
• 樣品測定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入10微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－15分鐘讀數(shù)） 

五、計算樣品活性

• 酶標(biāo)儀測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）到相應(yīng)孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）到相應(yīng)孔里
• 分別加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
• 活性計算

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 樣品中避免使用EDTA和EGTA等
• 加樣后3秒內(nèi)光度測定
• 測定值由高到低變化；測定持續(xù)15分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于15分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1） 
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 磷酸二酯酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠水解1微摩爾環(huán)核苷酸（cAMP或cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列磷酸二酯酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感