合成肽的生產(chǎn)涉及多個(gè)步驟，包括脫保護(hù)、活化、偶聯(lián)和從固相支持體上切割最終序列。雜質(zhì)，例如因過(guò)早鏈終止或缺失氨基酸產(chǎn)生的雜質(zhì)，會(huì)影響最終產(chǎn)品的安全性和有效性，因此，必須通過(guò)液相色譜分析分離這些雜質(zhì)。在液相分析中，選擇合適的流動(dòng)相和色譜柱對(duì)于各組分實(shí)現(xiàn)最佳分離至關(guān)重要。
采用島津LCMS-2050單桿質(zhì)譜儀，進(jìn)行多種流動(dòng)相、多柱的篩選，搭配LabSolutions MD軟件，有效提升合成肽相關(guān)雜質(zhì)方法開(kāi)發(fā)的效率。
此次研究基于一種肽和五種具有不同序列的有關(guān)雜質(zhì)作為合成肽的模型樣品(表1)。制備全長(zhǎng)肽(FLP:B-促黑素)、較短長(zhǎng)度產(chǎn)物的 p.A1del、p.A1_E2del、p.A1_K3del 和 p.A1、D5del的缺失序列以及 Met(O2)(FLP 中的甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸砜)作為樣品。
表1 靶肽和有關(guān)雜質(zhì)的序列
檢測(cè)條件
色譜柱
Shim-pack Scepter C18-120
(1.9μm,3.0x100mm)
Shim-pack GISS C18
(1.9μm,3.0x100mm）
Shim-pack Velox SP-C18
(1.8μm,3.0x100mm)
Shim-pack Scepter C8
(1.9μm,3.0x100mm)
Shim-pack Scepter Phenyl
(1.9μm,3.0x100mm)
Shim-pack GIST HP C18-AQ
(1.9μm,3.0x100mm)
柱溫：40℃
樣品溶劑：水
流動(dòng)相：
A：
Line A：0.1%三fu乙酸水溶液
Line B：0.1%甲酸水溶液
Line C：10mmol/L甲酸銨（pH=4）水溶液
Line D：10mmol/L乙酸銨（pH=5）水溶液
B：
Line A：乙腈
Line B：甲醇
流速：0.5mL/min
洗脫梯度：10%B（0min）→60%B（10 min）→10%B(10.01min-15min）
紫外檢測(cè)器：220 nm
質(zhì)譜系統(tǒng)：LCMS-2050
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
左右滑動(dòng)查看
不同色譜柱譜圖結(jié)果
對(duì)比流動(dòng)相和色譜柱的篩選結(jié)果，水相流動(dòng)相和有機(jī)相流動(dòng)相的組成對(duì) FLP 及相關(guān)雜質(zhì)的分離有顯著影響。基于LabSolutions MD軟件計(jì)算評(píng)估值，如表2所示。從中選擇的分析條件進(jìn)行進(jìn)一步方法優(yōu)化。
表2 不同色譜柱以及檢測(cè)條件數(shù)據(jù)評(píng)估值
圖1 評(píng)估值前三的色譜分離譜圖
進(jìn)一步優(yōu)化柱溫，考察篩選出評(píng)估值最高的3個(gè)檢測(cè)條件下，柱溫對(duì)于分離的影響。使用 Scepter C8-120 色譜柱，采用 0.1%甲酸和甲醇的流動(dòng)相，p.A1del和 FLP 之間的分離度更好。
圖2 不同柱溫箱溫度的色譜圖
80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(0.1%甲酸/甲醇/ScepterC8-120)
圖3 不同柱溫箱溫度的色譜圖
80℃(① ),70℃(②),60℃(③),50℃℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /乙腈:甲醇=50:50 /Velox SP-C18)
圖3 不同柱溫箱溫度的色譜圖
80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /甲醇/Scepter C8-120)
后期再進(jìn)行進(jìn)一步的條件優(yōu)化階段，通過(guò)調(diào)整起始流動(dòng)相比例、梯度條件、流速等進(jìn)一步提高分離度和穩(wěn)定性。
同時(shí)，使用LC-2050進(jìn)行峰追蹤，方便雜質(zhì)的識(shí)別。
最終結(jié)合LabSolutions MD，進(jìn)行最佳條件下的設(shè)計(jì)空間評(píng)價(jià)，通過(guò)疊加設(shè)計(jì)空間自動(dòng)搜索滿足多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的最佳條件。找到最佳的A檢測(cè)條件。實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)的有效分離。
結(jié)語(yǔ)
01
島津液相系統(tǒng)可自動(dòng)篩選多個(gè)流動(dòng)相和色譜柱，結(jié)合LabSolutions MD 提高合成肽相關(guān)雜質(zhì)方法開(kāi)發(fā)的工作流效率
02
島津多鍵合相色譜柱提供不同分析選擇性，助力多肽雜質(zhì)分離
產(chǎn)品信息
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