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γ-谷氨酰半*氨酸連接酶（GCL）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC1215
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二B：臨用前加2 mL蒸餾水充分震蕩溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，禁止反復(fù)凍融；

2. 試劑二的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑二A：試劑二B=260μL：104μL（共364μL，7T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當(dāng)天用完。

3. 試劑三：臨用前加5 mL蒸餾水充分震蕩溶解，2-8℃可以保存4周；

4. 試劑五：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存2周；

5. 試劑六：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存2周；

6. 工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑五：試劑六：試劑七=0.1mL：0.1mL：0.1mL（共0.3mL，3T）的比例配制，配好的工作液應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，限當(dāng)天使用。（注意：配制工作液最好使用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。）

7. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 μmol/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

8. 0.1μmol/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：臨用前取0.1mL 10 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液和0.9mL蒸餾水混合，配制濃度為1 μmol/mL；再取0.1mL 1 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液和0.9mL蒸餾水混合配制成0.1μmol/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液使用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH對(duì)GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子和炎癥因子等。GCL活性高低對(duì)GSH含量和GSH/*比值有重要影響。
在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷*酸和半*氨酸合成γ-谷氨酰半*氨酸；同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷分子，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出GCL活性。


注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、冷凍離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞破碎儀和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 樣本處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍

融。

1. 樣本測(cè)定前先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如吸光值大于1，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，哺乳動(dòng)物組織和血液一般稀釋3-5倍。

2. 細(xì)胞中GCL活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GCL的提取時(shí)可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。

3. 測(cè)定吸光值時(shí)請(qǐng)于水浴后10-40分鐘內(nèi)測(cè)完。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g三葉草加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.784-0.415=0.369，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

GCL（U/g 質(zhì)量）=0.0544×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷W=0.61 U/g 質(zhì)量。

1. 取0.1g柳樹加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.530-0.366=0.164，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

GCL（U/g 質(zhì)量）=0.0544×ΔA測(cè)÷ΔA標(biāo)÷W=0.271 U/g 質(zhì)量。
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