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聚乙二醇(PEG)沉淀試驗(yàn)檢測CIC
閱讀：2549 發(fā)布時(shí)間：2012-2-8聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一種無電荷的直鏈大分子多糖，可非特異性地引起蛋白質(zhì)沉淀。沉淀具有可逆性，被沉淀的蛋白質(zhì)生物活性亦不受影響。不同濃度的PEG可沉淀分子量不同的蛋白質(zhì)，在pH值、離子濃度等條件固定時(shí)，蛋白質(zhì)分子量越大，用以沉淀的PEG濃度越小。由于PEG 6000對蛋白質(zhì)沉淀具有良好的選擇性，所以在IC測定中主要采用PEG 6000。
PEG使IC沉淀的機(jī)理可能在于使其自液相中空間排斥而析出，此外，PEG還可抑制CIC解離，促進(jìn)CIC進(jìn)一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。在被檢血清中加入低濃度PEG，可將血清中的IC沉淀下來，利用透光率比濁或散射比濁法可測出CIC的存在與含量。本法簡便易行，國內(nèi)已廣泛應(yīng)用。
(一)試劑
1．0．1mol／L pH8．4硼酸鹽緩沖液(borate buffer solution，BBS) 硼酸(H3B03)3.40g，硼砂(Na2B407·10H20)4．29g，蒸餾水溶解后，加至1 000mL。用G3或G4玻璃濾器過濾。
2．PEG-NaF稀釋液 PEG 6 000 40．9g，NaF 10．0g，用BBS溶解后加至1 000mL，用G3或G4玻璃濾器過濾。
3．熱聚合人IgG 將人IgC(10mg/mL)置63℃水浴加熱15rain，立即置冰浴內(nèi)，冷卻后過Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱，收集*蛋白峰。所獲熱聚合人IgG可用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。也可取人IgG(10mg/mL)10mL，攪拌下滴加1．8％戊二醛100uL，24h后加入0．4mol/LpH5．4，Tris-HCl緩沖液100uL終止反應(yīng)，過Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱，用0．01mol／LpH7．4磷酸鹽緩沖液洗脫，收集*蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0．5％，分裝后—40℃保存。試驗(yàn)中可用作陽性對照和制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)操作步驟
1．取待測血清0．15mL，加BBS0．3mL(1：3稀釋)。
2．按表10—1加入各液(待測血清zui終稀釋倍數(shù)為1：33，PEGzui終濃度為3．64％)。
3．將測試管及對照管置37℃水浴60rrfin。
4．分光光度計(jì)在波長495nm測吸光度，用對照管調(diào)零。
(三)結(jié)果判斷
待測血清濁度值：(測定管吸光度—對照管吸光度)X100。以大于正常人濁度值的均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為CIC陽性。
參考值：4．3±2．0，以大于或等于8．3為CIC陽性。或以不同濃度熱聚合人IgG按以上方法操作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測血清吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得IC含量(相當(dāng)于熱聚合人IgG的ug/mL)。
(四)注意事項(xiàng)
1．低密度脂蛋白可引起濁度增加，故應(yīng)空腹采血。
2．高丙球血癥或血脂含量過高及標(biāo)本反復(fù)凍融，均可導(dǎo)致IC檢測出現(xiàn)假陽性。
3．此法快速、簡便，但特異性較差，較適用于血清標(biāo)本的篩查。