PA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知PA濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將PA和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中PA的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存）	96孔配置	48孔配置	配制
96/48人份酶標板	1塊板（96T）	半塊板（48T）	即用型
塑料膜板蓋	1塊	半塊	即用型
標準品：40ng/ml	1瓶（0.6ml）	1瓶（0.3ml）	按說明書進行稀稀
空白對照	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）	即用型
標準品稀釋緩沖液	1瓶（5ml）	1瓶（2.5ml）	即用型
生物素標記的抗ABA抗體	1瓶（6ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
親和鏈酶素-HRP	1瓶（10ml）	1瓶（5.0ml）	即用型
洗滌緩沖液	1瓶（60ml）	1瓶（30ml）	按說明書進行稀釋
底物A	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
底物B	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
終止液	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型

自備材料

1．蒸餾水。

2．加樣器：5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。

3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1．此試劑盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV為陰性，但沒有實驗室可*保證此血制品不會傳染肝炎、AIDS或其它傳染病，依據(jù)當?shù)氐陌踩珬l例處理本試劑盒里的成份及血清和血漿等樣品。

2．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

3．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

4．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項

1．試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。

2．實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6．洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。

7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

試劑的準備

1．標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

40 ng/ml	（6號標準品）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
20 ng/ml	（5號標準品）	100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
10 ng/ml	（4號標準品）	100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
5.0 ng/ml	（3號標準品）	100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.5 ng/ml	（2號標準品）	100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
1.25 ng/ml	（1號標準品）	100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml	（空白對照）	原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋。

操作步驟

1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作四次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育15分鐘。避免光照。

8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案

標準品濃度（ng/ml）

樣品

5.0

樣品

2.5

樣品

1.25

樣品

結(jié)果分析

以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的PA標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的PA含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

局限

6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

1．靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2．特異性：不與人其它細胞因子反應(yīng)。

3．重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

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植物磷脂酸（PA）ELISA 檢測試劑盒

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