賽默飛Attune CytPix 成像型流式細胞儀

成像效果更優(yōu)的流式細胞儀，可將形態(tài)學分析和流式細胞數(shù)據(jù)分析結合一起

• 屢獲殊榮的 Invitrogen Attune CytPix 成像型流式細胞儀將聲波聚焦與高速明場相機相結合，能夠同時進行高通量的流式細胞分析和高分辨率的明場成像 。

• 使用 Attune 流式細胞儀軟件進行自動圖像分析 ，可將事件特征轉(zhuǎn)換為形態(tài)參數(shù)，并可與標準熒光和散射參數(shù)結合使用。

應用文檔：自動圖像分析降低了流式細胞術設門策略的用戶間差異

Attune CytPix 成像型流式細胞儀榮獲醫(yī)療技術類 2003 年愛迪生獎™ 。Edison Awards 是廣受贊譽的獎項，旨在表彰在新產(chǎn)品和服務開發(fā)、設計和創(chuàng)新方面的出色表現(xiàn)。

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改善流式細胞術核心設施的研究

在流式細胞術中添加細胞圖像數(shù)據(jù)使研究人員能夠使用 MSU 流式細胞分析核心在細胞周期分析、內(nèi)生孢子周期與細菌中的納米顆粒攝取等方面取得新發(fā)現(xiàn)。聽聽 MSU 流式細胞術核心設施副主任 Daniel Vocelle 博士選擇 Attune CytPix 流式細胞儀的原因。

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使用 Attune CytPix 成像型流式細胞儀在一個工作流程中獲得兩個數(shù)據(jù)集

從流式細胞樣本中獲得更多數(shù)據(jù)而不影響速度。使用 Attune CytPix 將高參數(shù)流式細胞分析與自動化圖像分析相結合，以了解有關樣本的更多信息。

聲波聚焦技術可實現(xiàn)快速明場成像

在 Attune CytPix 流式細胞儀上采集樣本時，高速明場相機可采集并儲存檢測到的事件圖像，每秒可多達6000張，具體取決于流速和圖像大小。為實現(xiàn)更高靈活性，可使用 Attune 流式細胞儀軟件按需調(diào)整圖像采集頻率，并根據(jù)需要選擇特定的設門以進行圖像采集。聲波聚焦有助于定位細胞，從而獲得清晰的細胞圖像。

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聲波聚焦使得細胞處于良好成像位置

沒有采用聲波聚焦技術（左）時，微球沒有聚集在中心位置且經(jīng)常模糊不清。聲波聚焦（右）可減少橫向位置變異、時間變異和景深限制，從而可獲得清晰的圖像。

即使高通量采集也可以獲得穩(wěn)定的圖像質(zhì)量

聲波聚焦和高速相機相結合后，不論進樣速度快還是慢，都可以得到  CAR-T 細胞的穩(wěn)定成像。根據(jù)實驗需求輕松調(diào)節(jié)焦距和相機設置。

形態(tài)參數(shù)的自動圖像分析

Attune 流式細胞儀軟件 使用經(jīng)過白細胞和微球預培訓的模型，通過自動圖像分析功能得出形態(tài)參數(shù)。該軟件能夠以每秒高達1,000幅圖像的速率進行圖像分析，并且可由用戶在軟件后臺運行的進程隊列中進行管理。這些基于圖像的擴展參數(shù)提供了數(shù)據(jù)，使用戶能夠通過細胞計數(shù)（顆粒計數(shù)）和形態(tài)學特征（如圓形度 [圓度]、大小 [面積]、形狀 [偏心率] 和復雜性 [熵]）來確認單體。 對這些擴展參數(shù)設門后，您可以快速、準確地鑒別感興趣的細胞群，從而在不需要手動審查或僅需少量手動審查的情況下確認設門策略。

成像型流式細胞術的應用領域

單個事件的圖像和衍生的形態(tài)學數(shù)據(jù)可以幫助大量幾乎無限的流式細胞術應用。功能范圍包括： 

優(yōu)化和確認門控策略

利用圖像衍生的數(shù)據(jù)設門以排除雙聯(lián)體和碎片，并用圖像確認圈門的準確性。

更深入地表征細胞群

在現(xiàn)有流式方案中對不同形態(tài)的細胞群體進行記錄和表征。

分析細胞間相互作用

可視化并區(qū)分偶合事件與細胞間相互作用。

可視化大量細胞群的結構特征

使用高通量、詳細的圖像驗證

測量衍生的圖像參數(shù)

使用  Attune 流式細胞儀軟件6.0的圖像分析功能

高通量質(zhì)量控質(zhì)

通過向細胞培養(yǎng) QC 工作流程中加入快速成像結果，從而快速檢測質(zhì)量問題

優(yōu)化設門策略。即使是穩(wěn)健的手動單體設門也容易出錯，因此它仍是幾乎所有流式細胞分析測定的主觀決策點。成像結果有助于確認和調(diào)整設門，以便只圈出單個目的細胞。

在此，一名有經(jīng)驗的用戶已自信地為單體設門。 在評估手動單體門后，源自 CytPix 圖像的參數(shù) ParticleCount 顯示此門包含超過 4% 的聚合體。

也許更重要的是，這些事件含有表型明顯不同的細胞， 這可導致對雙陽性事件（特別是在稀有細胞群中）做出錯誤結論。

使用氯化銨裂解緩沖液裂解的老化人類全血 (AllCells)。圖像處理是使用 Cells Model_Speed Optimized 模型完成的。顯示的統(tǒng)計數(shù)據(jù)為門內(nèi)細胞百分比。

將流式結果與高速、高分辨率成像相結合，從而增加了設門和分析結果的準確性

細胞培養(yǎng)質(zhì)控。在質(zhì)量控制（QC）工作流程中增加快速成像可在早期階段發(fā)現(xiàn)和追蹤細胞培養(yǎng)相關問題。例如，在某實驗室中，在對 Ramos（淋巴瘤）細胞培養(yǎng)進行常規(guī)傳代檢查時觀察到，盡管看起來是在融合，但細胞計數(shù)和存活率減少。進一步檢測發(fā)現(xiàn)存在大量微生物污染，但這是從何時何處開始的？

由于該細胞系之前已經(jīng)在Attune CytPix 成像型流式細胞儀上進行了分析，研究人員重新打開圖像，發(fā)現(xiàn)至少五天前就記錄了微生物感染。當時，污染早期的跡象被誤認為碎片，但回顧性研究證實培養(yǎng)物中存在具有相同特征的問題細胞。追蹤感染幫助實驗室建立了額外的實驗室規(guī)程，以篩選和保護對實驗具有關鍵性作用的細胞系。

調(diào)查 Ramos 細胞培養(yǎng)的污染情況。

在一次常規(guī)傳代檢查時，培養(yǎng)物中的 Ramos（淋巴瘤）細胞顯示細胞計數(shù)和存活率減少，盡管看起來是在融合。進一步調(diào)查顯示有微生物污染，且通過 Attune CytPix 流式細胞儀的成像和反向設門得到證實。這種污染的早期跡象最初被誤認為是碎片。 

查看 Attune CytPix 成像型流式細胞儀更多樣本數(shù)據(jù)

表征細胞群。圖像中的形態(tài)學信息增加了流式細胞數(shù)據(jù)的豐度。 例如，圖中顯示了使用 Annexin V 和 PI 的常規(guī)細胞凋亡測定，添加了細胞成像以表征每個細胞群中的細胞，從而顯示不同形態(tài)特征。如果僅通過流式染色分析無法獲取該形態(tài)變化的信息。

凋亡細胞的形態(tài)特征。

用 10 µM XSJ 37oC 培養(yǎng) Jurkat 細胞 4 小時，以誘導細胞凋亡。樣本用 Annexin V 染色和 PI 染色后，在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上以 100 µL/分鐘的流速進行數(shù)據(jù)采集。從單個細胞群中，設門策略鑒別出三個細胞亞群。約 50% 的凋亡活細胞（Annexin V+PI–，右下）出現(xiàn)某種形式的凋亡小體，如氣泡。約 25% 的死的凋亡細胞（Annexin V+PI+，右上）的細胞表面顆粒度增大，且不完整細胞更多。約 10% 的健康細胞（Annexin V–，左下）有凋亡小體（盡管沒有 Annexin V? 細胞的那樣嚴重）。

"一張圖片雖然抵不上 1000 個點，但確實通過觀察圖像有助于進行數(shù)據(jù)分析。很高興能夠看與染色相關的圖像。例如，AnnexinV 陽性細胞的形態(tài)與健康細胞不同，或者 CD14⁺ 單核細胞比 CD3⁺/CD4⁺/CD14^- 淋巴細胞體積更大、內(nèi)容物更多。此外，它還可通過圖像查看單細胞門內(nèi)含有多少黏連細胞，并非常適合在分析中驗證異常雙陽性細胞的狀態(tài)。"

Kathryn Fox，

威斯康星大學麥迪遜醫(yī)學公共衛(wèi)生學院

分析細胞間相互作用。圖像甚至能顯示出細胞間的相互作用。 圖中，經(jīng)過基因改造的 CAR T 免疫細胞與 Ramos（淋巴瘤）細胞共同培養(yǎng)后進行染色，在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上進行采集和成像分析。第二象限的圖像（兩種染料均為陽性，作為單個事件采集）顯示 CAR T 細胞對靶向 Ramos 細胞具有明顯的殺傷作用，提供了改造后細胞具有功能的確切證據(jù)。

CAR-T 細胞殺傷靶向淋巴瘤細胞的成像結果。

分別使用 CellTrace Far Red 和 Violet 標記 CAR-T  和 Ramos 細胞并以 1:1 比例在 37°C 下孵育 1 小時。 在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上以 200 μL/分鐘、 >8 x 10⁵ 個細胞/mL 的設置采集未過濾樣本的圖像。第一象限（中上）、第四象限（右下）和第三象限（左下）的圖像分別顯示單個 Ramos 細胞、CAR-T 細胞和碎片。第二象限的圖像（對兩種染料均呈陽性，右上）顯示融合在一起的兩種細胞類型，這是作為單個事件采集的，因為 CAR-T 細胞吞噬了 Ramos 細胞。

我們之前展示了拍攝 CAR-T/Ramos 細胞相互作用圖像的能力?，F(xiàn)在我們來看看最感興趣的細胞群—雙陽性事件，以了解更多信息?，F(xiàn)在我們可以使用源自圖像的擴展參數(shù)（圓度與強度偏斜度）來進一步檢查這些細胞群的特征并改進這些事件的設門，從而提高數(shù)據(jù)穩(wěn)健性。在此，通過使用 基于圖像的定量參數(shù)的設門策略，我們可區(qū)分相互作用細胞與偶合事件，從而更準確地分析相互作用細胞。

CAR-T 細胞殺傷靶向淋巴瘤細胞的成像結果。

分別使用 CellTrace Far Red 和 Violet 標記 CAR-T 和 Ramos 細胞并以 1:1 比例在 37°C 下孵育1小時。在 Attune CytPix 成像型流式細胞儀上以 200 μL/分鐘、>8 x 105個細胞/mL 的設置采集未過濾樣本的圖像。第一象限（左上）、第三象限（右下）和第四象限（左下）的圖像分別顯示單個 Ramos 細胞、CAR-T 細胞和碎片。第二象限的圖像（對兩種染料均呈陽性，右上）顯示融合在一起的兩種細胞類型，這是作為單個事件采集的，因為 CAR-T 細胞吞噬了 Ramos 細胞。百分比為設門 %。

在細胞圖庫中，帶注釋的事件具有黑色輪廓，且?guī)в兄甘揪又卸ㄎ坏狞S點。圖像處理是使用 Cells_Half_Resolution_v22 模型完成的。利用圓度與強度偏斜度，使我們能夠區(qū)分黏連細胞相互作用（CAR-T 細胞與 Ramos 細胞間）與分離的細胞（即細胞處于同一視野中但未顯示出細胞相互作用）。

發(fā)現(xiàn)分析機會

利用Attune CytPix 成像型流式細胞儀對細胞進行反向設門，基于圖像形態(tài)可能發(fā)現(xiàn)更多感興趣的細胞亞群，而傳統(tǒng)流式數(shù)據(jù)無法提供這些信息。

例如，大腸桿菌細胞可培養(yǎng)為兩種菌落形成單位 (CFU)： 類似于單細胞的短 CFU，以及帶不裂變環(huán)的加長結構，代表在每個近似細胞長度處不縊縮。傳統(tǒng)單個細胞門（SSC-A/SSC-H）和熒光信號門（SSC/核染色）均無法區(qū)分這些細胞群。但通過 Attune CytPix 成像型流式細胞儀，可以查看和分類圖像信息，并根據(jù)其形態(tài)特征為不同 CFU 類型進行設門。

兩種大腸桿菌 CFU 類型的區(qū)分。大腸桿菌在 37oC 條件下培養(yǎng)過夜，然后在 4oC 條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天。使用 Attune CytPix 流式細胞儀以 100 μL/分鐘的流速進行樣本數(shù)據(jù)采集?？梢詮倪@些圖像鑒別兩類 CFU：(A) 代表單細胞的短菌落和 (B) 帶不裂變環(huán)的加長結構。各亞群細菌的典型圖像如圖所示。對所選圖像反向設門顯示兩個亞群在 FSC/SSC 點圖上不同（橙色點，左）。

視頻和演示

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提高流式數(shù)據(jù)的準確性

Attune CytPix 流式細胞儀現(xiàn)已具備自動圖像分析功能，可用于雙聯(lián)體辨別與活/死細胞分析等。使用這些功能可降低用戶間的差異，并提高流式細胞分析數(shù)據(jù)的準確性。

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將兩個工作流合并為一個，從而節(jié)省時間

無需分割樣品或修改您的流式細胞術實驗方案。簡化您的成像和流式細胞分析工作流程，節(jié)省時間。

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Attune CytPix 自動化圖像分析功能

Attune CytPix 成像型流式細胞儀的自動化圖像分析功能簡介。

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一步獲得更多數(shù)據(jù)

Attune CytPix 成像型流式細胞儀自動化圖像分析功能可在一個步驟中提供兩個數(shù)據(jù)集。

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改善流式細胞術核心設施的研究

在流式細胞術中添加細胞圖像數(shù)據(jù)使研究人員能夠使用 MSU 流式細胞分析核心在細胞周期分析、內(nèi)生孢子周期與細菌中的納米顆粒攝取等方面取得新發(fā)現(xiàn)。聽聽 Daniel Vocelle 博士

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流式細胞術實驗中成像數(shù)據(jù)的優(yōu)勢：小組討論

一組專家討論了在 Attune CytPix 流式細胞儀支持下進行流式細胞術實驗中成像數(shù)據(jù)的益處

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使用 Attune CytPix 流式細胞儀升級您的數(shù)據(jù)

觀看 Cora Chadick 博士展示 Invitrogen Attune CytPix 流式細胞儀

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克服流式細胞術常見挑戰(zhàn)的較佳做法

科學家 Greg Kaduchak 討論了利用 Attune CytPix 流式細胞儀的高分辨率明場成像來克服流式細胞術的難題。

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眼見為實

掌握更全面的情況以解答更多未知問題。(0:30)

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Attune CytPix 操作說明視頻

如何在 Attune CytPix 流式細胞儀上設置和采集流式細胞術和成像數(shù)據(jù)

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Attune CytPix Features and Benefits

Introduction video of the features and benefits of the Attune CytPix Flow Cytometer

賽默飛Attune CytPix 成像型流式細胞儀