標準品制備有關信息

本公司是一家技術服務型渠道企業(yè),在行業(yè)發(fā)展中所承擔的角色是一種溝通產出方和需求方（科研和市場）的媒介，我們致力為行業(yè)人才提供了包括科研在內的更多出口，為科研提供了有力的硬件支持，有效地促進科研和市場需求結合，提高了科研成果的轉化效率，使得科研更具活力。目前國家對于生物行業(yè)的發(fā)展給予了極大的重視，但更多地側重于科研的投入，行業(yè)內缺乏*的技術服務體系和渠道支撐...

1. 定量定義 定量是用已知濃度的標準品繪制標準曲線來推算未知樣品的量。 將標準品稀釋至不同濃度，作為模板進行 PCR 反應。以標準品拷貝數的對數值為 橫坐標，以測得的 CT 值為縱坐標，繪制標準曲線，對未知樣品進行定量時，根據未知樣品 的 CT 值，即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數。 （起始濃度）與循環(huán)數呈線性關系， 通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線， 即得 到該擴增反應存在的線性關系 * 由樣品 CT 值，就可以計算出樣品中所含的模板量

2. 定量標準品 標準品的一些標準 * 必須用與擴增目的基因相同的引物進行擴增，并且擴增效率相同 * 標準品必須是經過準確定量的（我們通常用的是 ASP-3700 紫外光/可見光微量分光光度 計） * 標準品必須是標準化的（例如，同一化的細胞數） * 在每組實驗時，必須用相同的閾值設定來確定 CT 值 標準品可以是含有目的基因的線性化的質粒 DNA，也可以是比擴增片段長的純化 后的 PCR 產物，當然也可以是基因組 DNA，甚至 cDNA，但前提是所有的作為標準品的核 酸都必須保證穩(wěn)定。

3. 標準品的制備
一般一條標準曲線取四到五個點， 濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間， 以保證定量
的準確性。 一般一個點重復三至五次， 對于常期穩(wěn)定使用的標準品可以適當減少重復的次數。 倍比梯度稀釋方法： 1v 原液（標準品 i）+9v 稀釋緩沖液，得標準品 ii 1v 標準品 ii+9v 稀釋緩沖液，得標準品 iii 1v 標準品 iii+9v 稀釋緩沖液，得標準品 iv 1v 標準品 iv+9v 稀釋緩沖液，得標準品 v 依次倍比稀釋 拷貝數的計算：詳見核酸拷貝數的計算

4. 實例標準品的制作：將標準品依次進行 10 倍稀釋，ASP-3700 測得其拷貝數 1.55×108copy /ul 標準曲線的繪制（1cycle=1min） 設置對照：濃度為 1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、 1.55×101 的標準樣品各一個，設空白對照 PCR 反應：以不同濃度標準品作為模板
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